Содержание
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЕТОДОВ ЕЕ ДИАГНОСТИКИ
1.1 Биологические свойства и классификация аденовирусов животных
1.2 Структурная организация вириона и роль белка гексона в формировании иммунного ответа
1.3 Современное состояние и перспективы развития серологических методов диагностики
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Характеристика использованных штаммов-продуцентов и генетических конструкций
2.2 Методы культивирования микроорганизмов и индукции синтеза рекомбинантных белков
2.3 Технологии очистки антигенов и постановки иммуноферментного анализа
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕКСОНА АДЕНОВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
3.1 Конструирование плазмидных векторов для экспрессии гена гексона
3.2 Оптимизация параметров биосинтеза целевого белка в гетерологичной системе
3.3 Выделение и оценка чистоты полученного рекомбинантного антигена
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
4.1 Определение оптимальных концентраций антигена для сорбции на твердой фазе
4.2 Оценка специфичности и чувствительности разработанной диагностической модели
4.3 Сравнительный анализ эффективности рекомбинантного белка и нативных вирусных антигенов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования обусловлена необходимостью совершенствования мер борьбы с инфекционными заболеваниями сельскохозяйственных животных, среди которых аденовирусная инфекция крупного рогатого скота занимает одно из ведущих мест. Данная патология характеризуется поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов, что ведет к существенному снижению продуктивности, задержке роста молодняка и значительным экономическим потерям в промышленном животноводстве [1]. Сложность своевременного выявления возбудителя связана с многообразием серотипов вируса и часто скрытым течением инфекции, что требует внедрения высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики.
Традиционные методы диагностики, основанные на выделении вируса в культурах клеток или использовании нативных антигенов, обладают рядом существенных недостатков, включая высокую трудоемкость, длительность процедур и необходимость работы с патогенным биологическим материалом. В современных условиях наиболее перспективным направлением является применение технологий рекомбинантных ДНК для получения очищенных вирусных белков [2]. Ключевым иммуногенным компонентом аденовируса является гексон — основной белок капсида, содержащий группоспецифические и типоспецифические детерминанты, что делает его идеальной мишенью для разработки серологических тест-систем, таких как иммуноферментный анализ [3].
Целью настоящей работы является получение рекомбинантного белка гексона аденовируса крупного рогатого скота в гетерологичной системе экспрессии и оценка его диагностического потенциала для выявления специфических антител в сыворотках крови животных. Достижение поставленной цели предполагает решение ряда научно-практических задач: проведение теоретического анализа существующих методов диагностики аденовирусных инфекций; конструирование плазмидных векторов, содержащих ген гексона; оптимизация условий биосинтеза и очистки рекомбинантного антигена; проведение сравнительного анализа эффективности полученного препарата в условиях иммуноферментного анализа.
Объектом исследования выступает процесс создания диагностического антигена на основе рекомбинантных технологий. Предметом исследования являются молекулярно-биологические и иммунохимические свойства рекомбинантного гексона аденовируса крупного рогатого скота. В ходе выполнения работы применялся комплекс современных методов, включая методы генной инженерии для создания экспрессионных конструкций, микробиологические методы культивирования штаммов-продуцентов, биохимические методы очистки белков с помощью аффинной хроматографии, а также аналитические методы оценки чистоты и специфичности полученных соединений [4].
Научная новизна исследования заключается в оптимизации параметров экспрессии гена гексона, обеспечивающих высокий выход растворимой формы белка, сохраняющего свои антигенные свойства. Практическая значимость работы определяется возможностью использования полученного рекомбинантного антигена для создания отечественных диагностических наборов, которые позволят проводить массовый мониторинг благополучия животноводческих хозяйств без использования дорогостоящих и опасных методов работы с живым вирусом [5]. Использование стандартизированного рекомбинантного белка обеспечивает высокую воспроизводимость результатов и исключает ложноположительные реакции, связанные с примесями клеточных белков, характерных для нативных антигенов [6]. Таким образом, разработка эффективной системы серологического контроля является важным шагом в обеспечении ветеринарной безопасности и эпизоотического благополучия агропромышленного комплекса.